應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-9

四、TaqMan Array Card運(yùn)行所需配套條件 

       TAC檢測(cè)本質(zhì)上依然是TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，只是反應(yīng)承載介質(zhì)不同。在操作流程中，核酸提純、反應(yīng)條件設(shè)定及數(shù)據(jù)分析并無(wú)二致。區(qū)別首先是上文所議的TAC陣列布局設(shè)計(jì)，其次是點(diǎn)樣后的TAC處理環(huán)節(jié)。 

       簡(jiǎn)單地說(shuō)，TAC上機(jī)運(yùn)行前，須完成以下5步操作： 

1） 上樣 

       移液槍頭吸取100 μL配好的PCR反應(yīng)液（含TaqMan Universal PCR Master Mix和模板）注入TAC加樣孔（Fill port）。

2） 離心 

       將已上樣的TAC插入特制的TAC適配器（Card holder）中，加樣孔在上，反應(yīng)孔朝向適配器有標(biāo)記的一面。將適配器插入離心機(jī)水平轉(zhuǎn)頭吊籃，轉(zhuǎn)速1200rpm(相對(duì)離心力331×g)離心兩次，每次1分鐘。 

3） 密封 

       將完成離心的TAC放入專用封片機(jī)TAC Sealer，手工完成密封。 

4） 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀運(yùn)行反應(yīng)模塊設(shè)置 

       TAC與其它常規(guī)96/384孔反應(yīng)板模塊，在儀器設(shè)置上有區(qū)別。 

       實(shí)驗(yàn)前須確認(rèn)儀器已安裝TaqMan Array Card反應(yīng)模塊。然后在儀器設(shè)置環(huán)節(jié)選擇 “384 Wells TaqMan Low Density Array”或“TaqMan Array Card ”或“TLDA”。 

       正確選定反應(yīng)模塊后，還需導(dǎo)入TAC樣品靶點(diǎn)設(shè)置信息對(duì)應(yīng)的SDS Setup文件（SDS Setup文件包含了TAC反應(yīng)孔靶位排列設(shè)置信息。文件可以被直接導(dǎo)入軟件），完成反應(yīng)板的設(shè)置（相當(dāng)于常規(guī)qPCR的plate setup操作）。 

5） 按儀器使用說(shuō)明完成其它設(shè)置，運(yùn)行實(shí)驗(yàn)并分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 

       上述操作流程中，須有以下配置要素支持，這是前提。 

4.1 配置TAC模塊的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 

       綜合目前Applied Biosystems一系列技術(shù)文件，確認(rèn)以下Real-Time PCR System可用于TAC檢測(cè)，包括： 

       7900HT Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)； 

       ViiA 7實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)： ViiA 7 Real-Time PCR System with TAC block（4453537）、ViiA 7 Dx（臨床診斷型）； 

       QuantStudio 7 Pro實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 7 Pro Real-Time PCR System with TAC block（A43186、A43165）； 

       QuantStudio 7 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 7 Flex with TAC block(4485700、4485696)； 

       QuantStudio 12K Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)：QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System with TAC block(4471089)；

       QuantStudio Dx實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)； 

       TAC專用反應(yīng)模塊（TaqMan Array Card Block，TAC sample block）工作套件包括TAC模塊熱蓋（384-Well/Array Card Heated Cover）、TAC模塊基座(Array Card Sample Block)和TAC模塊適配器（Array Card Adapter)三個(gè)部件。因不同機(jī)型安裝接口不完全一致，適用的TAC反應(yīng)模塊不完全兼容。 

       上述機(jī)型若未選配TAC Block，則需添加相應(yīng)TAC升級(jí)包才能實(shí)現(xiàn)TAC檢測(cè)功能，詳情見表2。 

表2 Applied Biosystems實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀TAC專用升級(jí)包

         升級(jí)包中配置了一個(gè)TAC樣品模塊, 一個(gè)TAC專用密封器（TaqMan Array Card sealer）和TAC離心專用套件（Array Card Bucket/Clip Set）。TAC離心套件須在滿足特定配置要求的離心機(jī)才能運(yùn)行。

          目前，除賽默飛TX-750水平轉(zhuǎn)頭外，eppendorf公司為5920R大容量臺(tái)式離心機(jī)開發(fā)了兩種TAC離心專用適配器。5920749005型適配器（2個(gè)/套）適用于S-4xUniversal-Large水平轉(zhuǎn)子套件（5895190006）；5825759001則需在S-4x1000轉(zhuǎn)子吊籃套件（5895118003）中使用。每個(gè)適配器同樣可固定3塊TAC板，4個(gè)適配器同時(shí)使用最多可離心12塊TAC。

4.2 專用離心機(jī)和配套轉(zhuǎn)頭 

       ABI為TAC離心所定制的套件包括Array Card Centrifuge Bucket 75015679和Array Card Holders 75015686（即Array Card Clip或Array Card Adapter），介紹此處從略，可點(diǎn)擊鏈接了解詳情。 

       據(jù)2021版官方資料，TAC離心套件是依托4×750mL水平轉(zhuǎn)頭TX-750(75003180)、TTH-750(75006445/75006434)開發(fā)的。它適用于以下型號(hào)賽默飛離心機(jī)： 

       Multifuge X4 Pro、Multifuge X4R Pro高通量高速低溫離心機(jī) 

       Sorvall ST4 Plus、Sorvall ST4R Plus高通量低溫離心機(jī) 

       Megafuge ST4 Plus、Megafuge ST4R Plus臺(tái)式大容量離心機(jī) 

       Sorvall X4 Pro、Sorvall X4R Pro臺(tái)式高通量離心機(jī) 

       Megafuge 40、Megafuge 40R臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī) 

       Multifuge X3、Multifuge X3R臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī) 

       Sorvall ST 40R臺(tái)式低溫高速離心機(jī) 

       Sorvall Legend XT、Sorvall Legend XTR低溫高速離心機(jī) 

       Sorvall Legend T Plus、Sorvall Legend RT Plus低溫高速離心機(jī) 

       SL40、SL40R臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī) 

       官方技術(shù)指南要求的TAC最大離心轉(zhuǎn)速 1200rpm，與此對(duì)應(yīng)最大相對(duì)離心力rcf 為331×g,離心2次，每次離心1分鐘，并確保轉(zhuǎn)速控制在指定范圍。 

       國(guó)內(nèi)外部分文章中把離心轉(zhuǎn)速/離心力寫成12000xg或1200xg，顯然有誤。

五、關(guān)于TaqMan Array Card方法應(yīng)用的幾點(diǎn)共識(shí) 

1）門庭冷落車馬稀 

       TAC檢測(cè)的高時(shí)效性、高通量性、高可靠性和高穩(wěn)定性表現(xiàn)，已被近20年來(lái)臨床、醫(yī)學(xué)、生物學(xué)研實(shí)踐所證明。然而PubMed數(shù)據(jù)顯示， [Text Word]為檢索范圍，2006年1月-2022年2月，所有與TAC應(yīng)用有關(guān)的論文總數(shù)僅區(qū)區(qū)1745篇。 

       另一方面，在ABI ViiA7上市前的2004-2010年，單依托7900HT Fast 實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)發(fā)表實(shí)驗(yàn)論文就多達(dá)4538篇。說(shuō)明：在7900HT Fast用戶中，僅有不到40%的實(shí)驗(yàn)室開展了TAC實(shí)驗(yàn)。從TAC上市至今，其公開發(fā)表的應(yīng)用案例數(shù)量（注：核查后實(shí)際數(shù)量比PubMed檢索的條目數(shù)少），與基于7900HT Fast、ViiA 7、QuantStudio 12K Flex、QuantStudio 7 Flex、QuantStudio 7 Pro系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀開展Taqman探針實(shí)驗(yàn)的論文基數(shù)比，簡(jiǎn)直可以忽略。 

       委實(shí)一派曲高和寡、叫好不賣座的慘象。 

2） 梅須遜雪三分白,雪卻輸梅一段香 

       澳大利亞莫納什大學(xué)科研人員，用TAC和常規(guī)qPCR方法完成了一項(xiàng)對(duì)墨爾本市政廢水及斐濟(jì)籍定居者定居點(diǎn)人、動(dòng)物和環(huán)境樣本中病原體的流行病學(xué)調(diào)查。在2021年5月Lancet Planet Health（IF19.17）的刊文中，對(duì)TAC方法與標(biāo)準(zhǔn)qPCR法的測(cè)試表現(xiàn)做了評(píng)價(jià)。對(duì)于添加基因片段的不含PCR抑制劑的樣本基質(zhì)，兩種檢測(cè)方法的特異性 (TAC 100%，qPCR 94%)、敏感性(TAC 92%，qPCR 100%)和定量準(zhǔn)確性(TAC 91%，qPCR 99%)相似。對(duì)取自實(shí)際居住點(diǎn)環(huán)境樣品中的8個(gè)腸道病原體靶點(diǎn)檢測(cè)，兩種技術(shù)定量結(jié)果一致性為89%。常規(guī)qPCR方法在檢測(cè)敏感性、準(zhǔn)確性和耐受樣本中PCR抑制劑干擾能力更勝一籌。 

       事實(shí)上，國(guó)內(nèi)外眾多刊文都提到，TAC檢測(cè)靈敏度、LOD性能指標(biāo)不及常TaqMan探針熒光定量法,對(duì)核酸樣品純度和品質(zhì)要求極嚴(yán)。因此，靶點(diǎn)豐度瀕臨TAC的LOD的測(cè)試樣品，極有可能出現(xiàn)摸棱兩可或假陰性結(jié)果。
       TAC方法的長(zhǎng)項(xiàng)在于一石多鳥，快刀斬亂麻。該方法有利于人們?cè)趶浱齑箪F中，快速確定方向、縮小搜索范圍并鎖定目標(biāo)。因此，可極大降低實(shí)驗(yàn)人力和時(shí)間耗費(fèi)，加快探索進(jìn)程，這是其核心價(jià)值。

3） 北畔是山南畔海，只堪圖畫不堪行 

       Lancet Planet Health一文中“Table 3: Comparison of TAC and qPCR for monitoring multiple pathogens”所提供的TAC實(shí)驗(yàn)成本測(cè)算數(shù)據(jù)顯示：常規(guī)qPCR法檢測(cè)中，每種靶標(biāo)不設(shè)重復(fù)情況下，試劑成本約為2.10美元。樣品數(shù)量增加所致試劑開支增加很少。但若靶標(biāo)設(shè)置為2個(gè)技術(shù)重復(fù)，則人工和試劑成本翻倍。而TAC測(cè)試，每個(gè)樣品的試劑成本約60美元，分?jǐn)偟矫總€(gè)靶標(biāo)后，試劑成本約1.28美元。 

       2020年，有國(guó)內(nèi)學(xué)者指出：TAC單孔檢測(cè)成本約是普通PCR板介質(zhì)qPCR實(shí)驗(yàn)的8倍。 

       若以Format 24型Custom Gene Expression TaqMan Array Card（4342249）來(lái)估算，每個(gè)靶標(biāo)設(shè)置2個(gè)重復(fù)、測(cè)試23個(gè)靶基因表達(dá)水平，不計(jì)前期mRNA提取純化、cDNA反轉(zhuǎn)錄、PCR預(yù)混液準(zhǔn)備環(huán)節(jié)試劑開支，單是TAC定制成本就2.8萬(wàn)元，折合每張TAC造價(jià)近2800元以上。再加上樣品準(zhǔn)備階段TaqMan 2×?Universal PCR master mix、RNA-to-cDNA反轉(zhuǎn)錄等必須試劑開支，每個(gè)樣品測(cè)試成本得超350元，這個(gè)價(jià)與國(guó)外報(bào)道的結(jié)論吻合。

參考文獻(xiàn)

［1］ Jie Liu, Jean Gratz, Caroline Amour, et al. A laboratory-developed TaqMan array card for simultaneous detection of 19 enteropathogens. Journal of Clinical Microbiology, 2013,51(2):472-480.
［2］Maja Kodani, Genyan Yang, Laura M. Conklin,et al. Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.J Clin Microbiol. 2011 Jun;49(6):2175-82.
［3］Jie Liu, James A Platts-Mills, Jane Juma,et al.Use of quantitative molecular diagnostic methods to identify causes of diarrhoea in children: a reanalysis of the GEMS case-control study. Lancet. 2016 Sep 24; 388(10051): 1291–1301.
［4］Martha S. Windrem, Mikhail Osipovitch, Zhengshan Liu, et al. Human iPSC glial mouse chimeras reveal glial contributions to schizophrenia. Cell Stem Cell. 2017 Aug 3; 21(2): 195–208.e6.
［5］Victoria Honnell, Jackie L. Norrie, Anand G. Patel, et al.Identification of a modular super-enhancer in murine retinal development. Nat Commun. 2022; 13: 253.
［6］Thomas Rio Frio, Amin Bahubeshi, Chryssa Kanellopoulou, et al. DICER1 mutations in Familial Multi-Nodular Goiter with and without Ovarian Sertoli-Leydig Cell Tumors. JAMA. 2011 Jan 5; 305(1): 68–77.
［7］Tomas Smutny, Jan Dusek, Lucie Hyrsova, et al. The 3-untranslated region contributes to the pregnane X receptor (PXR) expression down-regulation by PXR ligands and up-regulation by glucocorticoids. Acta Pharm Sin B. 2020 Jan; 10(1): 136–152.
［8］Cynthia L. Bethea, Arubala P. Reddy. Ovarian steroids regulate gene expression related to DNA repair and neurodegenerative diseases in serotonin neurons of macaques. Mol Psychiatry. 2015 Dec; 20(12): 1565–1578.
［9］Stephen Y. Chan, Ying-Yi Zhang, Craig Hemann, et al. MicroRNA-210 Controls Mitochondrial Metabolism during Hypoxia by Repressing the Iron-Sulfur Cluster Assembly Proteins ISCU1/2. Cell Metab. 2009 Oct; 10(4): 273–284.
［10］TaqMan Array Card簡(jiǎn)明中文手冊(cè)（MAN0026018 Rev. A修訂版）
［11］TaqMan Gene Expression Assays TaqMan Array Cards User Guide(4400263 Rev. G)
［12］TaqMan Array Cards Product Bulletin TaqMan Array Cards（COL1140540521）
［13］Rachael Lappan, Rebekah Henry, Steven L Chown, et al. Monitoring of diverse enteric pathogens across environmental and host reservoirs with TaqMan array cards and standard qPCR: a methodological comparison study. Lancet Planet Health. 2021 May; 5(5): e297–e308.
［14］徐君怡, 曹際娟, 鄭秋月, 等. 基于Taqman微流控芯片技術(shù)高通量檢測(cè)17種轉(zhuǎn)基因玉米品系. 分析化學(xué), 2020, 48(11): 1477-1485.
［15］虞惠貞，侯寒黎，尹文秀，等. 利用TaqMan微流控陣列同步檢測(cè)多種動(dòng)物源性成分.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版）,2020,46（2）：189-200
［16］ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System Specification Sheet (2003/09)