微需氧菌（microaerophilic bacterium）是指能在3% - 15% (v/v) 氧氣含量環(huán)境下生長(zhǎng)、在20-21%氧含量大氣及無(wú)氧環(huán)境中生長(zhǎng)受抑制細(xì)菌的統(tǒng)稱。除了空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni ）、幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,HP）等報(bào)道較多的人體致病菌外，還包括腸道中微需氧型雙歧桿菌，淡水、海洋硫化物等沉積物及廢水生物膜中硫酸鹽還原細(xì)菌（Sulfate-Reducing Bacterial, SRB），Zetaproteobacteria代表的近岸海洋沉積物、海底熱液環(huán)境中的嗜中性微需氧鐵氧化菌（FeOB）及從溫泉中分離的微需氧菌等多種寄生菌。

       微需氧菌常在含5%-O₂,10%-CO₂和85%-N₂的氣體環(huán)境、28- 42℃溫度下培養(yǎng)。培養(yǎng)方法有玻璃缸蠟燭培養(yǎng)法、氣囊培養(yǎng)法、厭氧罐培養(yǎng)法（Anaerobic Jar）、三氣培養(yǎng)箱法（multigas incubator）和微需氧工作站（Microaerobic Workstations）培養(yǎng)法等。

燭缸培養(yǎng)法和氣囊培養(yǎng)法難以穩(wěn)定維持的氣體含量。

       厭氧罐培養(yǎng)系統(tǒng)由氣瓶、氣體控制單元和培養(yǎng)罐組成，具有充排氣的氣體置換、氧氣（1%-15%)和CO₂（5%-15%）濃度的自動(dòng)控制功能，可提供穩(wěn)定低氧培養(yǎng)環(huán)境。系統(tǒng)無(wú)法調(diào)控培養(yǎng)罐工作溫度，故須將培養(yǎng)罐置于恒溫培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱或霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

       三氣培養(yǎng)箱(multigas incubator)具備常規(guī)微需氧菌培養(yǎng)所需的O₂（1% - 18%）、CO₂（0% - 20%）、溫度（RT+5℃ - +50℃）及濕度控制條件，但缺少樣品準(zhǔn)備環(huán)節(jié)低氧操作環(huán)境。

       微需氧工作站集O₂、CO₂及溫濕度自動(dòng)控制功能于一體，既是天然的低氧培養(yǎng)箱，又兼樣品制備的低氧環(huán)境操作臺(tái)，為微需氧菌實(shí)驗(yàn)樣品制備、接種培養(yǎng)和檢測(cè)分析全流程的解決方案。既可置于普通實(shí)驗(yàn)桌面工作，也可訂制專用工作臺(tái)架連同氣瓶、真空泵等輔助裝置安裝于實(shí)驗(yàn)室一角運(yùn)行使用。

       厭氧工作站和微需氧工作站兩者的整體結(jié)構(gòu)基本一致，故有廠商將二者合稱厭氧/低氧工作站，寓意可一機(jī)兩用。事實(shí)上，二者的治氧目標(biāo)、技術(shù)途徑、硬件配置及支持氣體均存在明顯區(qū)別。本文基于工作站的氣體環(huán)境調(diào)控機(jī)制來(lái)探討微需氧工作站軟硬件、配套氣體需求的特殊性，以便讀者在工作站的使用與選擇上胸有成竹。

一、微需氧工作站的艙內(nèi)環(huán)境調(diào)控機(jī)制

       微需氧工作站的一個(gè)核心功能是將工作艙內(nèi)空氣中氧分壓從20.9%降至5-6%的水平并長(zhǎng)期維持穩(wěn)定。在運(yùn)行前，工作艙內(nèi)充填的是空氣。

       若將空氣理想化為由O₂-21%、N₂-78.1%及1%其它氣體組成，無(wú)NO₂、H₂S、甲醛等有毒成份及塵埃污染的標(biāo)準(zhǔn)混合氣體。則無(wú)需將艙內(nèi)氣體抽出一半后，僅輸入CO₂、N₂，即可使艙內(nèi)氣體環(huán)境達(dá)到設(shè)定目標(biāo)。

       但因地域、環(huán)境、氣候及天氣等條件影響，加之空氣中的塵埃及硫化氫、揮發(fā)性有機(jī)物（VOC）、NO₂等有毒氣體污染的存在，為確保最終氣體環(huán)境一致性，標(biāo)準(zhǔn)流程應(yīng)是先真空排出工作艙內(nèi)空氣，再按氣體組成比例（如85%-N2：10%-CO₂：5%-O₂）輸入高純度工作氣體來(lái)完成氣體置換。

       在有氧呼吸鏈傳遞系統(tǒng)中，質(zhì)子和電子的最終受體是O₂。菌體從環(huán)境中攝取1mol O₂可產(chǎn)生2mol水蒸氣。微需氧菌一方面攝入CO₂，另一方面在有氧呼吸過(guò)程中消耗O₂并排放代謝產(chǎn)物CO₂和水蒸氣。微需氧菌攝取CO₂的動(dòng)機(jī)仍不十分清楚，但作為非固碳菌，理論上，培養(yǎng)過(guò)程中的排碳應(yīng)高于固碳。最終結(jié)果是：工作艙內(nèi)O₂消耗低于CO₂和水蒸氣的盡增長(zhǎng)，氣體總量上升。

       微需氧菌通常需在含高濃度（5%-10%）CO₂的氣體環(huán)境下培養(yǎng)。而系統(tǒng)根據(jù)O₂、CO₂傳感器檢測(cè)結(jié)果和控制算法，自動(dòng)輸入相應(yīng)流量的O₂、N₂，將O₂、CO₂的氣體分壓恢復(fù)至設(shè)定水平。通過(guò)自動(dòng)泄壓裝置釋放部分氣體，可保持艙內(nèi)氣壓的正常。無(wú)論是工作氣流輸入、艙內(nèi)氣壓維持，全部由系統(tǒng)自動(dòng)控制，無(wú)需人工干預(yù)。

       高純度的輸入氣體易造成培養(yǎng)基風(fēng)干脫水。數(shù)字化濕度控制單元可控制直熱式水汽蒸汽發(fā)生器或艙外水汽霧化裝置，將艙內(nèi)環(huán)境濕度維持在70% R.H.的默認(rèn)值或更高（85-95% R.H.）設(shè)定水平。當(dāng)艙內(nèi)濕度超過(guò)設(shè)定值，系統(tǒng)則啟動(dòng)除濕機(jī)制，風(fēng)扇驅(qū)動(dòng)艙內(nèi)氣體循環(huán)，在流經(jīng)半導(dǎo)體制冷控制冷凝器時(shí)，將水汽快速冷凝幫你改收集到艙外集水瓶中，從而降低艙內(nèi)濕度。

       微需氧菌培養(yǎng)環(huán)境溫度通常高于20℃-26℃的室溫。系統(tǒng)通過(guò)升溫加熱和柜體自動(dòng)對(duì)外輻射散熱的控溫機(jī)制，將艙內(nèi)溫度（RT+5℃-+65℃）維持穩(wěn)定。

       可見(jiàn)，在氣壓與溫濕度這幾個(gè)工作環(huán)境參數(shù)調(diào)控、真空泵運(yùn)用方面，微需氧工作站與厭氧工作站基本一致。二工作艙內(nèi)氣體環(huán)境調(diào)控的具體對(duì)象和調(diào)控機(jī)制，則存在根本區(qū)別。這就給微需氧工作站在配套體、硬件配置和系統(tǒng)控制層面都提出了不同要求。

二、微需氧工作站運(yùn)行配套氣體需求

       微需氧工作站艙要精確控制工作艙段O₂、CO₂兩種氣體的組成比例并保持穩(wěn)定，必然要從外部引入O₂和N₂氣體。在已知CO₂和水蒸氣分子總量盡增長(zhǎng)背景下，為維持5%-O₂、10%-CO₂和85%-N₂這一比例，O₂輸入量必高于實(shí)際消耗量，同時(shí)補(bǔ)充N₂。

       假設(shè)某個(gè)培養(yǎng)階段，工作艙內(nèi)消耗了2體積的O₂、新增1體積的CO₂排放。則系統(tǒng)需輸入輸入2.69體積O₂外加10.1體積N₂，或直接補(bǔ)充12.81體積的壓縮空氣中（O₂組成比例約21%），將艙內(nèi)O₂、CO₂比例恢復(fù)?？梢?jiàn)，用單一壓縮空氣替代相對(duì)昂貴的N₂、O₂兩種純凈氣體用作艙內(nèi)兩種氣體的補(bǔ)充來(lái)源方案，是經(jīng)濟(jì)而可行的。

       工作站的操作過(guò)程保留了N₂吹掃環(huán)節(jié)，以防外部空氣經(jīng)樣品轉(zhuǎn)移艙、袖套窗口與艙內(nèi)氣體對(duì)流而破壞艙內(nèi)O₂穩(wěn)態(tài)。因此，標(biāo)準(zhǔn)微需氧工作模式下，工作站運(yùn)行所需配套氣體為三種，即N₂（轉(zhuǎn)移艙及操作袖套的N2吹掃）、CO₂（在初始階段提供10%濃度的CO₂）和壓縮空氣（正常工作狀態(tài)下艙內(nèi)O₂含量的維持）。這與厭氧工作站的N₂+AMG、三氣培養(yǎng)箱的N2、CO₂雙氣源供氣模式都不同。

       包括幽門螺桿菌和空腸梭菌在內(nèi)，超過(guò)200種病原菌攜帶有氫化酶基因。氫化酶（hydrogenases）的作用在物種、不同菌株間存在差異。氫化酶不僅在微生物呼吸鏈中攝入的H₂裂解成電子和質(zhì)子，質(zhì)子氧化產(chǎn)能產(chǎn)生PMF。一些腸道菌群還借助于氫化酶發(fā)酵產(chǎn)升H₂，并在腸道組織中擴(kuò)散和飽和。幽門螺桿菌呼吸鏈中PMF產(chǎn)生具有結(jié)腸微生物群產(chǎn)H₂依賴性。鼠傷寒沙門氏菌、空腸彎曲桿菌、簡(jiǎn)易彎曲桿菌和幽門螺桿菌（包括致癌菌株）等幾種病原體，利用宿主結(jié)腸組織中分子氫為呼吸基質(zhì)（respiratory substrate），對(duì)其生長(zhǎng)和毒力表現(xiàn)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在培養(yǎng)氣體中添加H₂，幽門螺桿菌菌體數(shù)量在16小時(shí)內(nèi)實(shí)現(xiàn)40% - 60%的增長(zhǎng)，且10小時(shí)內(nèi)從[¹⁴C]碳酸氫鹽積累的碳增加了3倍。H₂使得幽門螺桿菌在胃腸道定植（colonization）中保持關(guān)鍵的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

       微需氧菌培養(yǎng)中是否需引入H2問(wèn)題，目前學(xué)界并無(wú)一致意見(jiàn)。但空腸彎曲桿菌、幽門螺桿菌的培養(yǎng)氣體中添加H2的應(yīng)用（(5%-O₂, 2%-H₂, 88%-N₂, 5%-CO₂）早有報(bào)道。從目前公開報(bào)道看，多數(shù)微需氧菌實(shí)驗(yàn)用的是三氣培養(yǎng)模式。

       加H2的辦法是在微需氧培養(yǎng)三組氣體基礎(chǔ)上增加一路H_2-N₂混合氣源。這樣，H2、N₂、CO₂和空氣構(gòu)成了微需氧工作站的四氣工作模式。

三、微需氧工作站的硬件配套要求

       厭氧工作站無(wú)論配置厭氧指示劑定性或氧氣傳感器定量監(jiān)測(cè)，均可滿足O₂含量控制在安全界限以下的調(diào)控要求。

       微需氧工作站在三氣模式下，要實(shí)時(shí)定量檢測(cè)O₂、CO₂兩種氣體含量，并根據(jù)傳感器讀數(shù)，自動(dòng)調(diào)整壓縮空氣的輸入量，確保O₂含量維持在設(shè)定值。而四氣工作模式下，則須在三氣應(yīng)用配置基礎(chǔ)上增加H₂傳感器及配套氣路控制單元。

       如采用肉眼觀察氧氣指示劑或氧氣傳感器讀數(shù)，人工計(jì)算、手工控制各種氣體的輸入量，容易出現(xiàn)操作失誤，以致艙內(nèi)氧氣含量偏離設(shè)定范圍，危及樣品安全。多個(gè)參數(shù)手工控制方式，極大增加操作負(fù)擔(dān)，對(duì)操作者個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)和操作熟練程度要求極高，不適用于大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)者。因此，微需氧工作站一般采用觸摸屏操作設(shè)置工作，系統(tǒng)通過(guò)PLC核心控制器，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置集中對(duì)多環(huán)節(jié)、多參數(shù)自動(dòng)化調(diào)控管理。市面上，DWS H35、江雪AG300 plus、Mini Station Plus、E500、E500G、QD500、E600，龍躍LAI-3T-N20、LAI-3DT等數(shù)字化自動(dòng)控制的機(jī)型，是可以用作微需氧培養(yǎng)基礎(chǔ)架構(gòu)的。

       微需氧氣體環(huán)境穩(wěn)定須依托對(duì)多種工作氣體流量的精確控制。采用三氣運(yùn)行模式的DWS H35、H25低氧工作站，設(shè)有N₂、CO₂和壓縮空氣三個(gè)獨(dú)立氣路接口，每個(gè)氣路的流量、啟閉都由系統(tǒng)獨(dú)立控制。而DWS M35微需氧工作站是標(biāo)準(zhǔn)四氣工作模式，內(nèi)部氣路結(jié)構(gòu)與控制模塊更為復(fù)雜。

       國(guó)產(chǎn)微需氧（低氧）工作站，一般基于標(biāo)準(zhǔn)厭氧工作站雙氣工作氣路結(jié)構(gòu)（一個(gè)N₂、一個(gè)AMG氣體）設(shè)計(jì)，標(biāo)準(zhǔn)配置下無(wú)法直接管控3-4種工作配套氣體。構(gòu)建微需氧環(huán)境，須引入獨(dú)立外置氣體混合器模塊。氣路具體接入方法是：N₂瓶與機(jī)身N₂專用輸入接口直接連接；CO₂、空氣及H₂需與氣體混合器上相應(yīng)氣體輸入接口連接，通過(guò)混合器輸出端口，與工作站的AMG輸入口對(duì)接。氣體混合器根據(jù)設(shè)置參數(shù)，可在多種氣體間切換和根據(jù)指令選擇性開放、關(guān)閉所需的氣體控制閥。

       當(dāng)然，系統(tǒng)軟件首先得有CO₂、空氣、H₂參數(shù)控制界面入口。DWS H35低氧工作站操作界面無(wú)H₂設(shè)置功能，可用于三氣模式下的微需氧環(huán)境控制，但不適用于四氣工作模式。

四、小結(jié)

       微需氧工作站集實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備操作和培養(yǎng)于一體，有效彌補(bǔ)常規(guī)缸蠟燭培養(yǎng)、氣囊培養(yǎng)、厭氧罐培養(yǎng)及三氣培養(yǎng)箱的缺少樣品操作空間上的不足。工作艙內(nèi)O₂、CO₂、H₂、溫度、濕度等工作參數(shù)全自動(dòng)、實(shí)時(shí)精確控制，是實(shí)現(xiàn)微需氧菌、微需氧寄生蟲（如藍(lán)賈第鞭毛蟲、陰道毛滴蟲等）、哺乳動(dòng)物細(xì)胞低氧培養(yǎng)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)工具。

       由于工作艙內(nèi)氣體調(diào)控對(duì)象、目標(biāo)方法的差異，微需氧工作站從系統(tǒng)控制軟件、艙內(nèi)氣體傳感器配置種類、工作氣體的輸入與控制單元，與厭氧工作站的應(yīng)用配置均顯著不同。一般說(shuō)來(lái)，通過(guò)簡(jiǎn)單的氣瓶更換，微需氧工作站可以秒變?yōu)閰捬豕ぷ髡?；但厭氧工作站要?shí)現(xiàn)到微需氧工作站的絢麗轉(zhuǎn)身，單靠靠邁出切換氣瓶這一步還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

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