應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-6

       伯樂MyiQ實(shí)時(shí)PCR儀配有一FAM/SYBR Green I熒光檢測通道，具備基因表達(dá)、基因拷貝數(shù)、陰陽判定等基礎(chǔ)分析功能。 

       Eppendorf Mastercycler ep realplex 2和伯樂DNA Engine Option 2代表的FAM/SYBR Green I和HEX/TET/VIC雙通道熒光檢測系統(tǒng)，可在一個(gè)反應(yīng)孔中同時(shí)檢測兩種熒光信號，使基因表達(dá)雙重PCR檢測(Duplex)、復(fù)雜SNP基因分型實(shí)驗(yàn)成為可能。但2個(gè)通道實(shí)時(shí)熒光PCR儀，不能檢測620nm波長信號，無法使用TaqMan Universal PCR Master Mix這類含ROX參比熒光染料的試劑，限制了進(jìn)行更復(fù)雜Multiplex定量分析或諸如LC Red 640一類染料標(biāo)記TaqMan探針檢測。于是，3通道的QuantiStudio 1和Stepone，4通道的QuantiStudio 3、SteponePlus和Stratagene Mx3000P、5通道的7500 Fast、QuantiStudio 6 Pro和CFX Opus 384等）和6通道的QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Flex、CFX96-Touch和CFX Opus 96等多檢測通道qPCR儀應(yīng)運(yùn)而生。不僅方便了Triplex、quadraplex、five-target甚至six-target這類多靶標(biāo)同步定量分析，還為系統(tǒng)兼容FRET雙雜交探針應(yīng)用提供了關(guān)鍵硬件支持。 

       2008年，LightCycler 480 II首開6個(gè)熒光檢測通道記錄，伯樂CFX 96、ABI Viia7于2010年前后腳尾隨而至。競爭驅(qū)動(dòng)下，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀新一輪擴(kuò)充熒光通道數(shù)量的革命快要來了嗎？

一、qPCR儀熒光信號采集流程的分析 

       實(shí)時(shí)熒光數(shù)據(jù)采集（Data Collection or Plate Read）時(shí)間點(diǎn)因?qū)嶒?yàn)類型而有區(qū)別。對于定量分析實(shí)驗(yàn)，無論是SYBR Green I染料，還是熒光染料標(biāo)水解探針、FRET雙雜交探針，通常是在PCR延伸步驟進(jìn)行數(shù)據(jù)收集。 

       PCR退火溫度是指體系中50%引物處于與模板結(jié)合狀態(tài)時(shí)的溫度。這一常識告訴我們，反應(yīng)孔內(nèi)引物、探針與模板片段的特異性結(jié)合并非頃刻間同步完成的，而是有一個(gè)持續(xù)數(shù)秒鐘時(shí)間的過程。故熒光數(shù)據(jù)采集是個(gè)動(dòng)態(tài)過程，系統(tǒng)自動(dòng)生成多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，最終將多個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集數(shù)據(jù)均值代表本循環(huán)熒光數(shù)據(jù)并存儲(chǔ)。 

       安捷倫Mx3000P qPCR系統(tǒng)中，用戶通過軟件的“高級算法設(shè)置”選項(xiàng)可對每個(gè)循環(huán)中熒光數(shù)據(jù)采樣次數(shù)設(shè)置（設(shè)定范圍1-31，默認(rèn)為3次）。系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算完成指定數(shù)量采樣所需的總讀板時(shí)間、決定每一論循環(huán)的首個(gè)數(shù)據(jù)采集啟動(dòng)時(shí)間。如，間隔7秒鐘采樣一次，每個(gè)循環(huán)收集數(shù)據(jù)3次，則系統(tǒng)將在每一循環(huán)的延伸步驟倒數(shù)第21秒這個(gè)時(shí)間點(diǎn)啟動(dòng)熒光數(shù)據(jù)采集（For example, if reading a plate takes 7 seconds and the specified number of data collection points is 3, the system will begin collecting data when 21 seconds remain in the plateau or ramp.）。如延伸步驟時(shí)間設(shè)定低于21秒，系統(tǒng)將提示時(shí)間設(shè)置無效。 

       默認(rèn)情況下，ABI PRISM 7700 Sequence Detection System每隔7秒中在PCR循環(huán)的延伸階段進(jìn)行一次熒光信號采集。CCD每次曝光持續(xù)時(shí)間25毫秒（可設(shè)定范圍為5-255毫秒）。增加曝光時(shí)間可增加熒光信噪比，有助于提高檢測性能。但延長曝光時(shí)間會(huì)產(chǎn)生2個(gè)不良后果：一是增加可能引發(fā)CCD過飽和，二是增加單次曝光時(shí)間后，特定PCR延伸時(shí)長內(nèi)系統(tǒng)數(shù)據(jù)采集次數(shù)須減少（fewer data points are collected in a given extension time），而這將影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。若想要維持?jǐn)?shù)據(jù)收集次數(shù)，則必須增加延伸保持時(shí)間。 

       資料表明，ABI PRISM 7700和Viia7系統(tǒng)軟件內(nèi)置算法會(huì)在PCR循環(huán)的延伸步驟后半段采集的3個(gè)數(shù)據(jù)的平均值來代表此循環(huán)的熒光數(shù)據(jù)信號強(qiáng)度值。延伸的時(shí)間至少為30秒，以確保延伸步驟期限完成數(shù)據(jù)采集操作（For best results, the extension step should be at least 30 seconds to allow collection of sufficient data.） 

       7700系統(tǒng)將這一步時(shí)間設(shè)定為60s，目的是在首次熒光數(shù)據(jù)采集前留出39s時(shí)間，達(dá)到常規(guī)三溫度循環(huán)中退火所需30s時(shí)長，確保雙鏈延伸得有效啟動(dòng)和持續(xù)一定時(shí)間。由于常規(guī)三步溫度循環(huán)法擴(kuò)增流程中，72℃延伸步驟時(shí)間通常不超過30s，不符合7700系統(tǒng)熒光數(shù)據(jù)采樣設(shè)計(jì)要求。

       因此，眾多實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑使用指南通常會(huì)提示，擴(kuò)增時(shí)應(yīng)根據(jù)所用儀器型號來設(shè)定延伸步驟的時(shí)長。如規(guī)定Roche、Bio-Rad和Agilent的qPCR儀的延伸時(shí)間不低于15s，ABI 7000/7300時(shí)間至少為31秒。 

       《實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)雙溫循環(huán)法的合理性及局限性》討論了qPCR實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增的雙溫循環(huán)法。人們?yōu)槌Ｒ?guī)短片段序列專門建立了anneal-extension兩步溫度循環(huán)法。其中一個(gè)重要原因就是這樣的退火/延伸合并步驟的時(shí)間設(shè)定具有極大靈活性，既有效滿足實(shí)驗(yàn)PCR擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性要求，又打破了傳統(tǒng)三溫度循環(huán)法中常用的延伸步驟中的時(shí)間長度不夠的約束，適應(yīng)了熒光信號采集的精準(zhǔn)度要求。此后，人們在此基礎(chǔ)上將60s時(shí)間壓縮為45s，以縮短qPCR反應(yīng)時(shí)長，提供實(shí)驗(yàn)效率。 

二、快速PCR反應(yīng)模式和多色熒光檢測帶來的新挑戰(zhàn) 

       需注意，7秒間隔和60℃最低維持30秒時(shí)長僅是標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)速度模式下單色熒光檢測所需反應(yīng)條件。 

       如《PCR升降溫速度在實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中的作用與意義-下》所述，若用7500 Fast、QuantiStudio 3/5/6/7、StepOnePlus系統(tǒng)的快速PCR模式，則擴(kuò)增循環(huán)各步驟持續(xù)時(shí)間大幅縮短，延伸時(shí)長不過10-15s。系統(tǒng)須啟用Fast模式實(shí)施熒光數(shù)據(jù)采集，即每個(gè)循環(huán)采集次數(shù)不變而縮短采樣時(shí)間間隔（3秒以內(nèi)），才能完成數(shù)據(jù)的有效采集。 

       若要進(jìn)行multiplex多色熒光實(shí)驗(yàn)，每次數(shù)據(jù)采集前須進(jìn)行設(shè)定熒光通道輪換這一必需動(dòng)作。我們LightCycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為例予以說明。

       LightCycler 480的熒光通道包含6個(gè)發(fā)射熒光濾鏡，安裝于步進(jìn)電機(jī)驅(qū)動(dòng)的濾鏡輪中。在multiplex分析中，各熒光檢測通道是一組組依次旋入旋出檢測工位完成相應(yīng)波長熒光數(shù)據(jù)的采集。濾鏡輪單次切換通道時(shí)間約0.65秒，這意味著完成5色熒光檢測時(shí)，Cyan 500通道信號采集時(shí)間點(diǎn)比CY5通道早3.25s，不同檢測通道熒光數(shù)據(jù)的時(shí)效性不一。 

       加大濾鏡輪直徑以容納更多濾鏡的研發(fā)成本和進(jìn)行更多色熒光檢測的必要性拋開不論，但檢測通道數(shù)量增加伴隨的技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)則應(yīng)引起重視。 

       首先，檢測通道輪換時(shí)濾鏡輪需反復(fù)啟動(dòng)、剎車，產(chǎn)生檢測時(shí)間遲滯。檢測通道越多，機(jī)械運(yùn)動(dòng)延遲也增多，完成全部熒光通道切換所需時(shí)間必然增加。 

       其次，也是最關(guān)鍵的，就是熒光通道越多，會(huì)造成不同熒光探針標(biāo)記樣品的信號采集時(shí)間差距被放大。LightCycler 480系統(tǒng)這一時(shí)差將由目前的3.9秒飆升至4秒以上。其結(jié)果是，同一反應(yīng)孔，靶標(biāo)1檢測時(shí)間比靶標(biāo)5時(shí)間提前了4秒，意味著靶標(biāo)1的延伸時(shí)間比靶標(biāo)5足足少了4秒鐘。延伸反應(yīng)時(shí)長的差別，勢必造成靶標(biāo)1擴(kuò)增產(chǎn)物量的在采樣點(diǎn)存在輕微差異，從而出現(xiàn)熒光通道測試值“后發(fā)優(yōu)勢”偏差現(xiàn)象。 

       其次是，在每輪數(shù)據(jù)采集時(shí)間期限內(nèi)，CCD數(shù)據(jù)采集可用時(shí)長被壓縮。檢測通道達(dá)到10個(gè)以上時(shí)，系統(tǒng)須將延伸步驟的首次數(shù)據(jù)采集時(shí)間點(diǎn)提前，或整體延長延伸階時(shí)間，方可有效完成數(shù)據(jù)采集，這必將使每輪熒光數(shù)據(jù)檢測值隨之改變。 

       伯樂CFX系列實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀光學(xué)檢測系統(tǒng)為光梭式（optics shuttle）結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。光梭移動(dòng)呈“弓”字形軌跡，從A1 →A12 →B12 →B2 →C3 →C12……直至H12完成整板信號采集。采集某一種熒光信號時(shí)，步進(jìn)馬達(dá)驅(qū)動(dòng)特定檢測光路移動(dòng)到被檢測反應(yīng)孔正上方并精確對準(zhǔn)反應(yīng)孔后再啟動(dòng)熒光的激發(fā)和信號采集，隨后移出工位。

       資料顯示，CFX Opus 96、CFX 96-touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀96孔板完成FAM通道掃描耗時(shí)3s，完成5色熒光采集所需最短時(shí)間為12s（考慮通道切換的時(shí)間遲滯，實(shí)際時(shí)長大于12s）。這表明：CH1通道(FAM)與CH5通道(Quasar 705/Cy5.5)的熒光信號采集時(shí)間存在高度異步現(xiàn)象，采樣點(diǎn)時(shí)差達(dá)12s之多。本應(yīng)與第1個(gè)靶標(biāo)同步數(shù)據(jù)采集的第5靶標(biāo)，額外增加了12s延伸反應(yīng)時(shí)間。這必然改變采用不同熒光標(biāo)記靶標(biāo)間熒光數(shù)據(jù)的真實(shí)、等效對比。

       Multiplex分析所用熒光檢測通道越多，不同靶標(biāo)熒光數(shù)據(jù)采集時(shí)間差距越大，檢測數(shù)據(jù)組間結(jié)果對比的失真現(xiàn)象越嚴(yán)重。 

表1 Optical Detection Performance Specifications of CFX Opus system 

       因此，目前普遍采用的qPCR光學(xué)模塊結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，已對進(jìn)一步增加檢測通道的數(shù)量構(gòu)成制約。 

       除非qPCR借鑒流式細(xì)胞儀的固定光路系統(tǒng)和空間立體激發(fā)技術(shù)。否則，進(jìn)一步增加熒光檢測通道不僅面臨研發(fā)成本難題，更重要的是會(huì)直接危害Multiplex等多色熒光檢測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性、可信性。  

參考文獻(xiàn)

［1］MxPro QPCR Software Instruction Manual for Mx3000P and Mx3005P QPCR Systems(Software version 4.10)
［2］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)
［3］LightCycler 480 Instrument Operator’s Manual Software Version 1.5
［4］CFX Opus 96 and CFX Opus 384 Real-Time PCR Systems Instrument Guide