應(yīng)用驅(qū)動型qPCR儀選型攻略-7

       SYBR Green I是科研qPCR實驗普遍使用的熒光染料。由于SYBR Green I可與包括PCR反應(yīng)非特異性產(chǎn)物在內(nèi)的所有dsDNA結(jié)合，故須在擴增結(jié)束后增加熔解曲線分析（Melting Curve analysis）以鑒別qPCR產(chǎn)物特異性，來驗證定量實驗結(jié)果。Tm接近的產(chǎn)物對熔解曲線分辨力要求極高，而實時熒光定量PCR儀的控溫性能和熒光染料屬性的不同無疑使得鑒別效力有別。有種說法是，用SYBR Green I做的qPCR實驗結(jié)果很難被牛刊編審認可。若實情如此，那melting curve analysis豈不白做？

       對TaqMan熒光探針法qPCR實驗，MIQE指南要求提供實驗標準曲線方程信息、PCR擴增效率、檢測極限(LOD)以及檢測動態(tài)線性范圍。對Multiplex real-time PCR，須注明每種靶標的擴增效率和LOD值。

       而SYBR Green I染料法qPCR實驗，指南規(guī)定：要有實驗陰性對照的Ct值，凝膠電泳、DNA測序、熔解曲線、擴增片段大小或DNA限制性內(nèi)切酶酶切實驗來進一步檢驗PCR產(chǎn)物特異性［specificity must be validated empirically with direct experimental evidence (electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size, and/or restriction enzyme digestion)］。這里restriction enzyme digestion用“and/or”的表述，說明是可選項；而electrophoresis gel, melting profile, DNA sequencing, amplicon size則是必選動作。

       那實際發(fā)文中，人們是如何貫徹MIQE指南的這個驗證政策的？

一、高分期刊論文中qPCR實驗SYBR Green I的使用現(xiàn)狀抽樣調(diào)查

       我們選擇了用Viia7實時熒光定量PCR儀和SYBR Green I染料法，且實驗結(jié)果發(fā)表在IF15以上期刊的實驗案例進行了調(diào)研。

       以［ViiA7[Text Word] AND PCR[Text Word] AND("0001/01/01"[PubDate] : "2021/09/30"[PubDate])］為檢索條件到3201條論文。篩選IF≥15期刊發(fā)文，對文章的正文、Supplementary Material相結(jié)合確認后，從入選37種期刊（包括了Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity等IF30分以上刊物）中，獲得176篇article。內(nèi)容涉及細胞生物學、免疫學、遺傳學、分子生物學、臨床醫(yī)學、微生物學等。再依據(jù)qPCR實驗用SYBR Green I、TaqMan探針法對文章分類計數(shù)。

表1  IF15以上期刊發(fā)表的基于Viia7系統(tǒng)進行的qPCR實驗論文列表（2021-09-30） 

       結(jié)果顯示：

       1.1 使用SYBR Green染料法與Taqman探針的qPCR實驗文章數(shù)量分別為113篇（64.20%） 和83篇（47.16%），其中17.04%的實驗同時采用了兩種方法；

       1.2 包括Nat Biotechnol、Nat Med、Nature、J Clin Oncol、Cell、Cancer Discov、Nat Genet、Cancer Cell、Immunity在內(nèi)的眾多頂級影響力期刊，對使用SYBR Green I染料標記法，未顯示歧視跡象； 

       1.3 對176個實驗應(yīng)用的“聚類”分析顯示，涉及基因表達相對定量分析、基因敲除/基因沉默驗證、基因絕對數(shù)量分析、基因分型鑒定、免疫共沉淀-定量PCR分析、miRNA調(diào)控功能分析、基因編輯與修飾水平分析、DNA損失修復(fù)機制和DNA去甲基化檢測等共10個類型。排除Multiplex多重定量PCR、SNP基因分型和臨床樣品病毒載量檢測，SYBR Green滲透入其他全部應(yīng)用類型。

表2  基于ViiA7系統(tǒng)開展實驗應(yīng)用分類表  

       這113個用SYBR Green I染料法進行的qPCR實驗中：

       針對所用引物序列提供了qPCR擴增運行協(xié)議詳細參數(shù)者，僅7篇；

       明確注明所用染料的制造商、貨號者僅一例；

       明確標注實驗所用儀器制造商、型號及反應(yīng)模塊信息者3例。

表3  quantitative PCR assay with melting curves analysis 

        對表3全部10篇文章的熔解曲線分析步驟所用染料類型及廠商信息確認結(jié)果表明，全部染料屬常規(guī)非飽和型SYBR Green I染料。

       其中，Jong Jin Jeong等人用瓊脂糖凝膠電泳+熔解曲線分析兩種方法證明PCR產(chǎn)物的特異性。

       而Britta Will等則采用熔解曲線分析和擴增子測序的驗證方法。雖仍不完全滿足MIQE指南的要求，但毋庸置疑，這個驗證流程的可信度最高。  

二、HRM在qPCR中應(yīng)用的特點和技術(shù)要求

       DNA雙鏈長度一致的情況下，堿基互補的雙鏈熱穩(wěn)定性通常要高于堿基錯配雙鏈。熔解曲線分析法是利用不同DNA雙鏈固有的Tm特征，通過均勻升高樣品溫度，使熱穩(wěn)定性不同DNA由雙鏈依次熔解成為單鏈。而只能結(jié)合dsDNA的SYBR Green I在dsDNA解鏈后，從局部解鏈的DNA 分子上脫落，發(fā)射熒光信號強度隨之劇減。故通過實時檢測升溫過程熒光信號的變化，可對PCR產(chǎn)物中不同DNA組份進行區(qū)分。

       高分辨率熔解曲線分析（High Resolution Melt，HRM）技術(shù)源于熔解曲線分析，所不同的是它需依托高分辨率熔解溫度控制裝置和飽和性DNA熒光染料的支持。

2.1 HRM分析用的飽和熒光染料

       飽和熒光染料與DNA結(jié)合的特性不同非飽和熒光染料（最常用的是SYBR GreenⅠ）。高濃度SYBR GreenⅠ會抑制PCR 反應(yīng)，故在熒光定量實驗中所用濃度很低，無法達到使DNA 雙螺旋小溝全部飽和結(jié)合的程度。最關(guān)鍵的是，DNA解鏈過程中，染料在從已解開的呈單鏈狀態(tài)部分片段上脫落的同時會轉(zhuǎn)到臨近的、尚未解鏈的雙鏈殘部并與之結(jié)合（結(jié)合部位重排）而繼續(xù)發(fā)射熒光。DNA雙鏈已開始熔解，但樣品熒光強度卻短暫地維持不變，監(jiān)測的溶解曲線無法實時準確反應(yīng)DNA解鏈狀態(tài)，對溫度分辨率降低。

       常用的飽和熒光染料有evaGreen、LC Green/LC Green Plus、SYTO 9、ResoLight等。飽和熒光染料（PCR抑制作用極其微弱可以忽略）可在DNA雙鏈中所有可結(jié)合位點分布，與DNA的結(jié)合呈飽和狀態(tài)。在雙鏈熔解過程中，尚未解鏈的雙鏈殘部已因無染料可結(jié)合位點，染料無法轉(zhuǎn)移重排而從DNA雙鏈上解離，染料熒光強度立即消失。故飽和染料溶解曲線分析熒光信號變化可以實時、準確反映DNA雙鏈隨著溫度解鏈情況，據(jù)此有效區(qū)分DNA片段堿基組成的細微差異。具有高靈敏、高分辨率的特點和善于鑒定純合型序列突變的巨大優(yōu)勢。

2.2 HRM分析所需硬件支持

       計算表明，單核苷酸多態(tài)性（SNP）的純合野生型（homozygous wild-type）、純合突變型（homozygous mutant）擴增子間Tm存在0.0~1.3℃不等差異。單個SNP的異源雙鏈DNA（heteroduplex）比最穩(wěn)定型同源雙鏈DNA（homoduplex）的Tm低1.1-3.0℃。單堿基復(fù)合雜合突變序列（compound heterozygotes），與純合野生型序列Tm差異不過2.8–4.0℃。

? 表4  Human SNP Occurrence and Tm 

        跨越Tm溫差范圍所需時間相對于2.2-3℃的PCR變溫速度太過短暫（最低可設(shè)定為0.050℃/s）。但早期的ABI 7700、LightCycler 1.2/2.0等實時熒光定量PCR儀的CCD數(shù)據(jù)采樣間隔高達數(shù)秒（見《實時熒光定量PCR儀檢測通道數(shù)量擴充的革命來啦？》），無法實現(xiàn)溶解曲線熒光信號實時采集，更遑論用于HRM分析。

       在HRM技術(shù)初創(chuàng)時，PCR產(chǎn)物先以20℃/s速率被加熱到90℃，接著以相同速度冷卻到40℃以充分形成各種異源二聚體。再用高分辨率熔解曲線儀將樣品溫度以0.3℃/s的標準速率均勻升高，同時以不低于10次/℃的采樣密度監(jiān)測65℃ -95℃范圍熒光信號變化。市面HRM分析儀CCD采樣頻率高達100-200次/秒。

       可見，若同時進行96個樣品HRM分析，則qPCR熱循環(huán)模塊溫控精確性（≤0.3℃）、均一性（≤±0.3℃），軟件需自動調(diào)整CCD熒光數(shù)據(jù)采集頻率，以適應(yīng)曲線熔解步驟數(shù)據(jù)檢測要求。

        早期的實時熒光定量PCR儀，控溫精度近±0.4℃，孔間溫差高達±0.4-0.5℃，用于Tm差異2℃以上非特異性二聚體鑒別尚可，無法勝任復(fù)雜SNP檢測。

       目前，包括賽默飛ViiA7、QuantStudio 1、QuantStudio 3/5、QuantStudio 6 /7 Pro、StepOne / StepOnePlus、7500 Fastreal-time PCR system，伯樂CFX96/384、CFX96/384-touch及CFX Opus 96/384real time PCR Detection system在內(nèi)多款實時熒光定量 PCR儀，可用飽和型熒光染料和HRM軟件實現(xiàn)HRM分析功能。

       LightCycler 480II是采用SimplProbe探針進行SNP分型鑒定。

三、關(guān)于SYBR Green染料法在qPCR實驗中應(yīng)用的思考

3.1 SYBR Green I單峰勢單力薄
       SYBR Green I最早僅限用于Tm相差超過2℃ PCR擴增片段的鑒別。
       對在囊性纖維化基因I507/F508區(qū)域擴增產(chǎn)物的熔融曲線實驗也證實，相同片段，SYBR Green I測得的Tm值比采用5 –熒光標記引物對照組高2℃。對長度41-44 bp的雜合樣本的熔解曲線分析結(jié)果顯示，5 –熒光標記引物組圖出現(xiàn)了與預(yù)期一致的兩個同源雙鏈產(chǎn)物+兩個異源雙鏈產(chǎn)物峰。而SYBR Green I標記組每個基因型只有一個同源雙鏈產(chǎn)物峰。
       說明，不同基因型擴增產(chǎn)物Tm差異減小會使SYBR Green I分辨力喪失，產(chǎn)物特異性驗證失效。憑SYBR Green I染料熔解曲線單峰表現(xiàn)，斷言qPCR擴增的特異性顯然不夠。

3.2 HRM高分辯曲線亦須審慎
       基因組水平上單堿基突變引起的DNA 序列多態(tài)性，有同型堿基之間（G-A或T-C）的轉(zhuǎn)換、嘌呤與嘧啶(A-T、A-C、C-G、G-T) 之間的顛換、單個堿基插入和堿基缺失4大類型。顛換純合突變片段Tm值存在0.8～1.4℃的差異。但轉(zhuǎn)換純合突變片段間的Tm值區(qū)別極其細微（通常＜±0.4℃），甚至qPCR儀用HRM分析難以分辨。
       此外，隨著擴增片段長度增加，HRM檢測靈敏度和特異性降低。對于僅1-2 bp堿基差異大片段分型時，HRM技術(shù)分辨率是不夠的。
       對復(fù)雜遺傳背景擴增產(chǎn)物特異性驗證的可信性，HRM技術(shù)與TaqMan熒光探針是有差距的，不可同日而語。

3.3 MIQE指南所言入木三分
       正因為SYBR Green I熒光染料標記技術(shù)的固有缺陷，業(yè)內(nèi)對其在qPCR實驗的應(yīng)用保持謹慎的態(tài)度。MIQE指南在引物和探針序列經(jīng)BLAST分析驗證、擴增結(jié)束引入熔解曲線分析基礎(chǔ)上，要求對qPCR產(chǎn)物特異性引入凝膠電泳甚至基因測序?qū)嶒灤_認。但時至今日，學界對MIQE指南規(guī)定的qPCR實驗結(jié)果驗證的技術(shù)方法意見依然不統(tǒng)一。
       SYBR Green I、LC Green、evaGreen、SYTO 9等熒光染料標記法對于qPCR實驗，當用盡用，毫無疑問。
       熔解曲線或HRM分析之外增加PCR產(chǎn)物凝膠電泳條帶專一的驗證，確是MIQE力挺的。雖有可能招來“沒必要”這類善意“中評”，但應(yīng)祝賀！因為實驗者對qPCR驗證的思想境界顯然已對標Cancer Discov刊文作者啦！

參考文獻 

［1］Stephen A. Bustin, Vladimir Benes, Jeremy A. Garson, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry, 2009;55:4611–622
［2］譚昌淵,羅九甫,任兆瑞.高分辨率熔解曲線分析—分子診斷的新技術(shù).生命科學研究, 2009，13(3):268-271
［3］Cameron N. Gundry, Joshua G. Vandersteen, Gudrun H. Reed, et al. Amplicon Melting Analysis with Labeled Primers:A Closed-Tube Method for Differentiating Homozygotes and Heterozygotes. Clinical Chemistry，2003；49(3):396–406
［4］Luis B. Barreiro, Ricardo Henriques, Musa M. Mhlanga. High-Throughput SNP Genotyping: Combining Tag SNPs and Molecular Beacons. Single Nucleotide Polymorphisms. 2009; 578: 255–276.
［5］ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User′s Manual(904989B,01/2001)
［6］Robert Graham, Michael Liew, Cindy Meadows,et al. Distinguishing Different DNA Heterozygotes by High-Resolution Melting.Clin Chem. 2005;51(7):1295-8
［7］A Guide to High Resolution Melting (HRM) Analysis（Thermo Fisher）