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如何用MIQE標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的流程與驗(yàn)證設(shè)計(jì)?-下
應(yīng)用驅(qū)動(dòng)型qPCR儀選型攻略-8
三、按MIQE要求建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法的實(shí)例分析
對(duì)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析性能的評(píng)價(jià)，MIQE指南設(shè)立了qPCR validation一環(huán)，實(shí)驗(yàn)者提供必要信息事項(xiàng)便于審核qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中E類（essential information）為必須隨稿件提交的信息，而D類（Desirable information）屬應(yīng)盡可能提交信息項(xiàng)。
表2 MIQE checklist for qPCR validation
序號(hào) | qPCR實(shí)驗(yàn)信息審查項(xiàng) | 重要性 | qPCR反應(yīng)信息項(xiàng)說(shuō)明 |
1 | Specificity(gel, sequence, melt, or digest) | E | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法分析特異性指當(dāng)樣本中有其他非特異性靶標(biāo)存在情況下，用qPCR法可針對(duì)性地檢測(cè)到目標(biāo)序列的能力。凝膠電泳/測(cè)序/熔解曲線等均可用于證明qPCR反應(yīng)特異性。 多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的特異性還需交叉反應(yīng)法驗(yàn)證。用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的靶標(biāo)有： 1）同源性核酸序列，或引起相同或相似癥狀的其他病原體核酸； 2）被檢測(cè)基因的其他基因型片段或其他基因型構(gòu)建的質(zhì)粒等基因工程產(chǎn)品； 3）高濃度的其他核酸對(duì)目標(biāo)核酸的交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。 |
2 | Calibration curves with slope and y-intercept | E | 建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線目的在于評(píng)估目標(biāo)片段擴(kuò)增效率和依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算待測(cè)樣品中目標(biāo)片段模板初始含量，同時(shí)評(píng)估定量檢測(cè)有效線性范圍。 內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品可用載有靶基因線性化質(zhì)粒DNA、比目的擴(kuò)增片段長(zhǎng)的純化靶基因PCR產(chǎn)物或基因組DNA、濃縮的cDNA模板。須與靶基因同步擴(kuò)增和具有相同擴(kuò)增效率 1）用標(biāo)準(zhǔn)品和建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣本中靶序列絕對(duì)數(shù)量測(cè)定。 每個(gè)靶基因的絕對(duì)定量都需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)須為每種靶基因建立一標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將含有已知靶序列拷貝數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)連續(xù)等比稀釋（如1:2、1:3、1:10倍率稀釋）制備至少5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)技術(shù)重復(fù)。標(biāo)準(zhǔn)品的靶基因拷貝數(shù)范圍達(dá)到5-6個(gè)對(duì)數(shù)量級(jí)，足以覆蓋待測(cè)樣品的濃度區(qū)間，以確保定量準(zhǔn)確性。 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀記錄樣本和標(biāo)準(zhǔn)品各稀釋液的Cq值（每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定熒光信號(hào)閾值時(shí)所擴(kuò)增循環(huán)數(shù)），并以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液中靶序列拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為x軸，該稀釋度Cq值為y軸，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線并給出線性擬合方程y=kx+b。將樣品測(cè)試Cq值代入方程計(jì)算出樣品的靶基因起始拷貝數(shù)。 2）相對(duì)定量多重實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)，多個(gè)靶標(biāo)可共同一個(gè)內(nèi)參，建立一條內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線和進(jìn)行靶標(biāo)的歸一化處理。 |
3 | r2 of calibration curve | E | 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)自動(dòng)給出曲線的回歸相關(guān)系數(shù)R2值。它代表標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的單個(gè)Cq數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的擬合程度。R2值越接近1，說(shuō)明曲線與測(cè)出數(shù)據(jù)吻合程度越高。 通常R2值>0.99被視為測(cè)試數(shù)據(jù)線性關(guān)系較理想。 |
4 | PCR efficiency calculated from slope | E | 使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中回歸線的斜率k來(lái)計(jì)算出擴(kuò)增效率: PCR效率=10 -1/k -1 理論上k=-3.32，實(shí)際擴(kuò)增時(shí)k值在-3.59～-3.10（對(duì)應(yīng)于反應(yīng)效率是90-110%）是較理想的狀態(tài)。 |
5 | Linear dynamic range | E | 線性動(dòng)態(tài)范圍/標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍 （PCR反應(yīng)的動(dòng)態(tài)范圍，即平均校準(zhǔn)曲線法的從最高到最低定量拷貝數(shù)。動(dòng)態(tài)范圍應(yīng)跨越5-6個(gè)1og10濃度范圍或至少達(dá)到3個(gè)數(shù)量級(jí)，以覆蓋所檢測(cè)目標(biāo)的定量范圍。 |
6 | Evidence for LOD | E | 單重qPCR的檢測(cè)極限(Limit of Detection，LOD) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法分析靈敏度可用檢測(cè)極限表示。LOD是在特定分析程序在95%概率的下可以準(zhǔn)確測(cè)定的樣本中待測(cè)核酸模板的最低樣本濃度（最小拷貝數(shù)）。當(dāng)濃度在LOD水平處的待測(cè)樣本進(jìn)行多次重復(fù)測(cè)定，95%的概率可有效測(cè)定，而檢測(cè)失敗概率小于5%，則該濃度視為置信區(qū)間95%條件下的LOD。 標(biāo)準(zhǔn)曲線中b為y軸的截距，代表x軸上最低拷貝數(shù)的靶模板產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增時(shí)的理論Cq值和檢測(cè)方法的理論最低檢測(cè)限（可能是3拷貝/PCR。假設(shè)符合泊松分布，PCR有95%的概率檢測(cè)到1個(gè)拷貝）。 LOD常表述為單位質(zhì)量的組織或單位體積的液體中模板的拷貝數(shù)(copies/μg或copies/μl)。 |
7 | Cq variation at LOD | E | LOD時(shí)的Cq變化 定量下限的界定時(shí)，應(yīng)提供整個(gè)線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的CIs值，報(bào)告線性范圍內(nèi)最低濃度處的變異。 |
8 | If multiplex, efficiency and LOD of each assay | E | 多重qPCR反應(yīng)中每個(gè)分析目標(biāo)的擴(kuò)增效率和LOD 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，多組引物-探針混合情況下，分別為每種測(cè)試靶標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)估在多重反應(yīng)條件下每種靶標(biāo)的擴(kuò)增效率和測(cè)試LOD值。 |
9 | For SYBR Green I,Cq of the NTC | E | 陰性對(duì)照NTC的Cq（SYBR Green I適用） （在實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中，應(yīng)設(shè)置無(wú)模板對(duì)照（NTC）孔，即含有水或緩沖液的反應(yīng)孔但不含樣本模板的反應(yīng)孔。陰性對(duì)照反應(yīng)孔中不應(yīng)發(fā)生陽(yáng)性的擴(kuò)增信號(hào)） |
10 | Evidence of optimization (from gradients) | D | 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件最適的證明 常規(guī)多重PCR通常須分別進(jìn)行單重PCR確定各引物和模板用量、退火溫度和擴(kuò)增循環(huán)數(shù)等擴(kuò)增條件。據(jù)此進(jìn)一步優(yōu)化多重引物混合反應(yīng)的擴(kuò)增參數(shù)，確立多重PCR體系。特別是各組引物退火溫度不一時(shí)，通過(guò)梯度溫度實(shí)驗(yàn)來(lái)優(yōu)化體系整體退火參數(shù)。 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中，雙溫度循環(huán)法的退火-延伸參數(shù)固化，因此多重PCR中梯度溫度優(yōu)化，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)中不再作硬性要求。 但可提供多重PCR體系反應(yīng)體積、各引物-探針組用量配比、循環(huán)次數(shù)和（或）退火溫度優(yōu)化方法和結(jié)果予以說(shuō)明。 |
11 | CIs for PCR efficiency or SE | D | PCR效率的置信區(qū)間（confidence intervals，CIs）或標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error，SE） 平均PCR效率的CIs或SE值需對(duì)同一批樣品采用相同操作流程和實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行的多次校準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的方法得到，下同）。 |
12 | CIs throughout range | D | 整個(gè)檢測(cè)范圍的置信區(qū)間(CIs) （需對(duì)同一批樣品進(jìn)行多次重復(fù)標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)確認(rèn)置信區(qū)間95%條件下樣品濃度的檢測(cè)范圍） |
我們以德國(guó)霍恩海姆大學(xué)研究人員發(fā)表的《建立一種四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法鑒別大豆感染的真菌病原體D. longicolla，D. caulivora，D. eres和D. novem》為例，梳理多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析方法的創(chuàng)建流程，使之符合MIQE指南要求。
3.1 實(shí)驗(yàn)研究背景
大豆莖潰瘍病菌（Diaporthe）為間座殼屬真菌，以菌絲形態(tài)寄生于種子、植株和土壤中。植株感染后發(fā)生莖桿腐爛而嚴(yán)重影響大豆產(chǎn)量，屬各國(guó)禁止入境的檢疫性有害生物物種。
全球食用非轉(zhuǎn)基因大豆需求增長(zhǎng)迅猛，加之氣候變暖，中歐大豆種植擴(kuò)大，加劇大豆莖潰瘍病菌傳播風(fēng)險(xiǎn)。植物病理專家確定D. longicolla（DPCL），D. caulivora（DPCC），D. eres（DPCE）和D. novem（DPCN）四種大豆莖潰瘍病菌為該地區(qū)優(yōu)勢(shì)物種，嘗試建立從種子、植株中快速可靠同時(shí)檢測(cè)這4種病菌方法，用于豆種病原污染評(píng)估、篩選及開(kāi)展大豆田間流行病學(xué)監(jiān)測(cè)。
3.2 四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析法建立步驟
表3 Step by Step of the establishment for quadruplex real-time PCR assay
Items | Steps | Materials and methods descriptions | Remarks |
| 1 | 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR目標(biāo)確立 | 建立可同時(shí)鑒別DPCL、DPCC、DPCE和DPCN四種真菌的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR梵音檢測(cè)體系 | |
2 | 引物（和）探針組設(shè)計(jì)和評(píng)估 | 基于TEF基因設(shè)計(jì)4種菌種特異性引物探針組： 1) sequence alignments：ClustalW as implemented in BioEdit (version 7.1.3.0); 2) Tm and potential secondary structures of primers and probes evaluated with Gene Runner (Version 6.5.52 Beta); 3) specificity of the primers evaluated by NCBI’s Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/); | 1）多重實(shí)時(shí)熒光PCR的正反向引物、熒光標(biāo)記探針3個(gè)寡核苷酸均須是序列高度特異（如與其他序列結(jié)合會(huì)降低PCR效率、出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果）； 2）BLAST軟件序列特異性檢查； 3）4重實(shí)時(shí)熒光PCR體系需鑒定12個(gè)寡核苷酸序列的特異性。 |
4種真菌TEF序列通用正、反向引物設(shè)計(jì) （擴(kuò)增4種病原菌的TEF基因片段） | 擴(kuò)增產(chǎn)物既作熒光定量PCR引物探針特異性、靈敏度驗(yàn)證測(cè)試靶，又用作單重、多重定量PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品 | ||
大豆看家基因GmUKN2引物設(shè)計(jì) （定量樣品中大豆DNA數(shù)量） | 大豆DNA作為外參，計(jì)算單位質(zhì)量的豆種中病原菌DNA量，評(píng)估真菌感染程度 | ||
| 3-1 | 待測(cè)和各種對(duì)照品DNA提取 | 4種培養(yǎng)的目標(biāo)真菌菌絲基因組DNA的分別提取 | PCR產(chǎn)物制作定量?jī)?nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)目標(biāo) |
其他非目標(biāo)病原菌DNA的分別提取 | 設(shè)立單獨(dú)反應(yīng)孔作對(duì)照，評(píng)估各引物-探針組的特異性 | ||
健康大豆植株中提取DNA | 作陰性對(duì)照設(shè)立單獨(dú)反應(yīng)孔，驗(yàn)證探針的特異性） | ||
人工DPCL菌屬感染的大豆莖稈、種子和種皮中分別提取DNA | 用于實(shí)際檢驗(yàn)四重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的有效性 | ||
3-2 | 4種目標(biāo)菌種TEF DNA序列PCR擴(kuò)增 | Diaporthe isolates TEF regions amplifications TEF regions primers EF1-728F (5’-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3’) and EF1-986R (5’-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3’) in individual reactions for the different Diaporthe isolates. 25μl Reaction mixtures: 2.5μl 10x Taq buffer with (NH4)2SO4 (Thermo Fisher Scientific), 2.5μl 2 mM dNTPs, 2.5μl MgCl2 (25 mM), 12.5 pmol of each primer set, 1μl Taq DNA polymerase (1 U/μl), and 1μl genomic DNA. Amplification conditions: 3min - 95℃, 35 cycles (denaturation 30s -95℃, annealing 30s - 68℃, elongation 30s - 72℃), and a final 5min -72℃ elongation. PCR products were checked on 2% agarose gels electrophoresis. PCR products were purified using the PEQGOLD Cycle-Pure Kit (PEQLAB Biotechnologie) and determined by Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). PCR products containing 109 to 104 copies/μl, diluted with DNA prepared from soybean tissue, roughly 20ng, 2ng, 200pg, 20pg, 2pg, 0.2pg, and 0.02pg DNA per reaction. | 1）本例內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品用的是各目標(biāo)菌屬的TEF基因擴(kuò)增片段； 2）文中實(shí)驗(yàn)結(jié)果中的標(biāo)準(zhǔn)品起始濃度范圍為20ng – 0.02pg共7個(gè)數(shù)量級(jí)；實(shí)際配制了覆蓋10-1010 copies共10個(gè)數(shù)量級(jí)的標(biāo)準(zhǔn)品。 |
3-3 | 4種目標(biāo)真菌基因組DNA樣品制備測(cè)定 | genomic DNA of the Diaporthe isolates was both determined by measuring absorption at 260nm and by Qubit 2.0. 1:10–1:106 dilution series were prepared with 50 μg/ml DNA prepared from healthy soybean tissue. | 1）各目標(biāo)菌種DNA提取樣品用健康大豆DNA稀釋液稀釋成1/10、1/100、1/1000三個(gè)濃度梯度（模擬真實(shí)檢測(cè)樣品基質(zhì)條件測(cè)試），以降低DNA樣品中PCR抑制成分干擾，確認(rèn)實(shí)測(cè)條件。 2）目標(biāo)菌株DNA樣品用于評(píng)估多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系引物-探針組的特異性。 |
4-1 | Assessing the specificity of the primer-probe sets | singleplex real-time PCR assays amplification efficiency Assessing: using serial dilutions of PCR products(10 to 109 copies) for amplification standard curves; Assessing conditions of the test for Diaporthe infestations, 1:1,1:10,1:100,1:1000 serial dilutions of genomic DNAs from the different Diaporthe isolates were also used for quantification standard curves; non-target Diaporthe species No-template controls were included 20μl Reaction mixtures:10μl ready to use SensiFAST Probe No-ROX mix (2x) (Bioline GmbH),8 pmol of each forward and reverse primers,2 pmol probe,2μl template DNA； Amplification conditions: 3 min at 95℃ and 40 cycles of 95℃ - 15s and 60℃ - 45s； CFX96 Real-Time PCR system (Bio-Rad) FrameStar 96-Well Skirted PCR Plates (4titude, USA) | DPCL、DPCC、DPCE和DPCN四引物-探針組擴(kuò)增效率、特異性單重實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)驗(yàn)證 1）分別用四種菌株DNA、非目標(biāo)菌株DNA及空白對(duì)照，逐一測(cè)試每各引物-探針組特異性； 2）以四TEF基因PCR產(chǎn)物作標(biāo)準(zhǔn)品分別建立單重?zé)晒舛繕?biāo)準(zhǔn)曲線，檢驗(yàn)在避免PCR抑制干擾理想情況下單重反應(yīng)的擴(kuò)增效率和檢測(cè)限； 3）用4種菌株DNA提取液的1:1、1:10、1:100、1:1000稀釋液為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)實(shí)測(cè)條件下的擴(kuò)增效率和條件； |
4-2 | Assessing the specificity of the primer-probe sets | Duplex real-time PCR assays with primer-probe combinations （consists of 4 in individual reactions: parallel dilution series of both species，and one undiluted (20ng) genomic DNA combined with 1:1000 diluted genomic DNA of the other species） DPCL+DPCC DPCL+DPCE DPCL+DPCN DPCC+DPCE DPCC+DPCN DPCE+DPCN Reaction mixtures：10μl 2x SensiFAST Probe No-ROX mix, and a reduced amount of 4pmol of each primers set, 1 pmol of each of the two probes, and 2μl template DNA. Amplification conditions: as Duplex | 引物探針組特異性的交叉檢驗(yàn)：將4個(gè)引物探針組兩兩配對(duì)（6種組合）進(jìn)行雙重?zé)晒釶CR實(shí)驗(yàn)。 1）對(duì)平行稀釋DNA混合測(cè)試：分別對(duì)兩種病原菌的未稀釋(20ng)的DNA混合物、兩種1/1000稀釋DNA混合物檢測(cè)； 2）對(duì)兩種不同稀釋度真菌DNA（一種1:1而另一種1/1000稀釋）的混合測(cè)試，檢驗(yàn)當(dāng)一種模板濃度遠(yuǎn)高于另一個(gè)模板濃度情況下競(jìng)爭(zhēng)抑制和多重反應(yīng)有效性。如對(duì)DPCL+DPCC組合的測(cè)試分為： ①未稀釋DPCL+稀釋DPCC DNA混合； ②稀釋DPCL+未稀釋DPCC DNA混合； |
4-3 | Specificity of the quadruplex real-time PCR assay | 1）4種引物-探針組組合同時(shí)對(duì)2種真菌檢測(cè) DPCL + DPCC；DPCL + DPCE；DPCL + DPCN；DPCC + DPCE；DPCC + DPCN；DPCE + DPCN 2）4種引物-探針組組合同時(shí)對(duì)檢測(cè)3種真菌檢測(cè) DPCL + DPCC + DPCE；DPCL + DPCC + DPCN；DPCL + DPCE + DPCN；DPCC + DPCE + DPCN 3）4種引物-探針組組合同時(shí)對(duì)4種真菌檢測(cè) DPCL + DPCC + DPCE + DPCN 4）4種引物-探針組組合對(duì)其他大豆病原菌種檢測(cè) Reaction mixtures：as Duplex Amplification conditions: as singleplex. | 四重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系特異性檢驗(yàn) 1）4個(gè)引物探針組混合，測(cè)試2種、3種靶DNA共存時(shí)的特異性。 2）4個(gè)引物探針組能同時(shí)檢測(cè)四種靶DNA的特異性。 3）所有情況下，各引物探針組均專一性擴(kuò)增靶DNA。非目標(biāo)菌體、健康大豆葉和莖的DNA測(cè)試均無(wú)擴(kuò)增。 |
4-4 | 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)體系標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 | Standard curves establishing for the quadruplex real-time PCR assay DNA isolates from 4 target Diaporthe species were diluted with DNA prepared from soybean tissue, roughly 20ng, 2ng, 200pg, 20pg, 2pg, 0.2pg, and 0.02pg DNA per reaction； The standard curves used to calculate the amount of Diaporthe DNA in ng per reaction； a rough estimate of the limit of detection (LOD) and a Cq cut-off values. | 分別取4種菌株DNA，用健康大豆DNA連續(xù)稀釋制備的內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)。 分別建立4個(gè)靶基因標(biāo)準(zhǔn)曲線； 確定各靶標(biāo)檢測(cè)的LOD（和Cq的cut-off值） |
5 | 多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)方法的實(shí)測(cè)驗(yàn)證 | Validation of the quadruplex real-time PCR assay 1）Infected soybean stems detect DNA from Diaporthe spp. prepared from stem samples covered with pycnidia. D. longicolla DNA was detected in all tested samples with visible symptoms. For healthy stem samples the primer-probe sets produced no amplification. 2）Screening soybean seeds All four Diaporthe species could be detected in different seed samples known to contain seeds infected with Diaporthe strains. For healthy seeds no amplification. | 用實(shí)際感染目標(biāo)真菌的大豆植株樣品和大豆種子和健康大豆種對(duì)照，檢驗(yàn)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系有效性。 |
6 | Reaction mixtures for quantifying soybean DNA | Reaction mixtures：10μl 2x SensiFAST SYBR No-ROX mix, 8 pmol each of primers GmUKN2f and GmUKN2r, and 2μl template DNA. as Duplex Amplification conditions: as singleplex. No-template controls were included | 用大豆GmUKN2基因作為外參，計(jì)算單位大豆中真菌基因含量，評(píng)估感染風(fēng)險(xiǎn)和鑒定豆種品質(zhì)。 |
對(duì)照表3、4可以看出：MIQE指南中qPCR驗(yàn)證1-10個(gè)E類項(xiàng)，文中都悉數(shù)提供。D類項(xiàng)目的多重反應(yīng)體系優(yōu)化細(xì)節(jié)（如多重PCR引物-探針組組分間配比優(yōu)化過(guò)程、循環(huán)次數(shù)優(yōu)化、最終反應(yīng)體積的優(yōu)化和退火延伸溫度選擇等）、標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)的多次重復(fù)確認(rèn)LOD依據(jù)、LOD檢測(cè)限置信區(qū)間和LOD對(duì)應(yīng)的Cq值SD均未見(jiàn)補(bǔ)充說(shuō)明。此外，關(guān)于實(shí)驗(yàn)方法的Repeatability（E類）和Reproducibility（D類），文中也未提供說(shuō)明。
相對(duì)而言，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法建立全流程，從單重反應(yīng)到多重反應(yīng)的建立、反應(yīng)特異性驗(yàn)證及擴(kuò)增效率評(píng)估方面，資料詳實(shí)。
文中引入了多組引物-探針并存、高濃度非靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)條件洗的檢測(cè)特異性評(píng)估實(shí)驗(yàn)，在同類應(yīng)用文獻(xiàn)中少見(jiàn)，符合MIQE指南要求，尤其值得借鑒。
四、討論
4. 1多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)“重”數(shù)的問(wèn)題
多重PCR反應(yīng)是指在單個(gè)反應(yīng)孔/管內(nèi)用數(shù)組特異性引物同時(shí)擴(kuò)增數(shù)個(gè)靶序列。“重”是指同一孔內(nèi)被同時(shí)擴(kuò)增的特異性序列的種數(shù)。單管內(nèi)模板達(dá)到兩種（雙重PCR反應(yīng)）即被視為多重反應(yīng)。
多重PCR可以通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和反應(yīng)條件提高擴(kuò)增的片段種屬。 理論上，只要PCR擴(kuò)增條件合適，重PCR實(shí)驗(yàn)的模板重?cái)?shù)可以不受限制。文獻(xiàn)表明，受限于反應(yīng)體系優(yōu)化難度，常規(guī)科研實(shí)驗(yàn)以2-9重模板的反應(yīng)多見(jiàn)。但多重PCR與毛細(xì)管電泳平臺(tái)（如Beckman GenomeLab GeXP多基因遺傳分析系統(tǒng)，Agilent 2100 Bioanalyzer等）結(jié)合，一次反應(yīng)可對(duì)魚(yú)類細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控、脂質(zhì)代謝、糖皮質(zhì)激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、氧化應(yīng)激和炎癥等生理反應(yīng)22個(gè)關(guān)鍵基因和3個(gè)對(duì)照基因的表達(dá)同時(shí)分析。而NGS測(cè)序的文庫(kù)構(gòu)建中，同步擴(kuò)增模板可達(dá)數(shù)千重且上不封頂（high-multiplex PCR或ultrahigh-multiplex PCR和超多重PCR的提法純屬噱頭，PubMed可查論文使用其概念者屈指可數(shù)）。
然而，多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中模板重?cái)?shù)擴(kuò)展則力不從心。
在多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中，每種擴(kuò)增片段用正反向引物對(duì)+熒光標(biāo)記探針組合標(biāo)記，以便有效區(qū)分同一反應(yīng)孔內(nèi)的不同種靶序列的擴(kuò)增信號(hào)。一色熒光占用一個(gè)檢測(cè)通道。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀可同時(shí)使用熒光通道配置決定了單孔內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)的靶序列“重”數(shù)。需指出，各品牌實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀標(biāo)稱的檢測(cè)通道數(shù)，并非完全等同于可同時(shí)檢測(cè)的熒光顏色種數(shù)（見(jiàn)《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀熒光檢測(cè)通道數(shù)量的內(nèi)涵淺析》）。目前QuantiStudio 5、QuantiStudio 7 Pro、QuantiStudio 7 Flex和ViiA7等平臺(tái)，基于熒光探針?lè)ǖ亩嘀貙?shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測(cè)極限是6重。
將TOCE技術(shù)、多重PCR反應(yīng)和HRM分析結(jié)合建立的Anyplex II RV16多重?zé)晒釶CR檢測(cè)套裝，突破6重限制，在單管中同時(shí)檢測(cè)8種病毒基因。
無(wú)論熒光探針或HRM多重?zé)晒舛縋CR分析，對(duì)“重”的定義是一致的，即：須是在同一個(gè)反應(yīng)孔(而非分散于多個(gè)孔）內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增的靶標(biāo)種數(shù)。
4.2 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)多少重為宜？
多重?zé)晒舛縋CR分析中，引物和探針設(shè)計(jì)特異性和有效性（不同靶點(diǎn)引物-探針要確保序列特異性，還需使引物Tm值差異可控以確保所有引物在同一個(gè)溫度下退火延伸）、反應(yīng)組份優(yōu)化程度（各擴(kuò)增片段數(shù)量、擴(kuò)增效率不同，間存在抑制競(jìng)爭(zhēng)效應(yīng)。豐度高靶點(diǎn)擴(kuò)增的先發(fā)數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)，過(guò)多消耗dNTP和TaqDNA酶，會(huì)抑制較低豐度靶點(diǎn)擴(kuò)增）是擴(kuò)增效率的主要限制因素。
此外，特異性驗(yàn)證流程有BLAST序列特異性檢查、單重反應(yīng)驗(yàn)證、多重交叉驗(yàn)證、高濃度競(jìng)爭(zhēng)抑制驗(yàn)證等4個(gè)環(huán)節(jié)。分析靶標(biāo)種數(shù)增多，引物和探針設(shè)計(jì)難度加大，兩兩組合交叉驗(yàn)證工作量隨之劇增。
相對(duì)而言，3重實(shí)時(shí)定量反應(yīng)，驗(yàn)證環(huán)節(jié)實(shí)驗(yàn)量較4重反應(yīng)減少1/3。就效費(fèi)比，3重定量PCR方法要優(yōu)于4重反應(yīng)。
設(shè)計(jì)5-6重實(shí)時(shí)熒光PCR實(shí)驗(yàn)，首先是設(shè)計(jì)和性能驗(yàn)證更復(fù)雜繁瑣。其次，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀所配檢測(cè)通道要能支持6色熒光同時(shí)檢測(cè)。因部分機(jī)型檢測(cè)通道的信號(hào)采集時(shí)間不同步，首末兩個(gè)通道檢測(cè)的靶標(biāo)在信號(hào)采集時(shí)退火-延伸反應(yīng)時(shí)間不對(duì)稱。靶標(biāo)種數(shù)越多，2個(gè)通道信號(hào)采集點(diǎn)時(shí)差越長(zhǎng)，不同通道對(duì)應(yīng)靶標(biāo)退火進(jìn)程有別，必會(huì)影響靶標(biāo)數(shù)據(jù)檢測(cè)準(zhǔn)確性和信號(hào)強(qiáng)弱對(duì)比（見(jiàn)《實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)通道數(shù)量擴(kuò)充的革命來(lái)啦？》）。
因此科研應(yīng)用中，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的模板重?cái)?shù)應(yīng)量力而行。
4.3 多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)規(guī)范化問(wèn)題
在引物和探針商業(yè)化定制服務(wù)便利化、實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)95℃-60℃雙溫度循環(huán)擴(kuò)增盛行的背景下，實(shí)施多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR，依然面臨反應(yīng)體系組分配比優(yōu)化（可參考《Multiplex polymerase chain reaction: a practical approach》、《Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol》等經(jīng)典文獻(xiàn)）和多重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)方法驗(yàn)證的難點(diǎn)。
臨床診斷、檢驗(yàn)檢疫和生物醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)，對(duì)定量PCR方法的準(zhǔn)確性、敏感性、特異性、線性范圍CIs、LOD/LOB/LOQ、Cq的CV值等分析性能要素不盡相同。因此，MIQE指南把退火溫度優(yōu)化、PCR效率及線性檢測(cè)范圍置信區(qū)間信息項(xiàng)列為D級(jí)，不作強(qiáng)制要求。
調(diào)研表明，越是在高分期刊的發(fā)文，在按MIQE指南要求設(shè)計(jì)和驗(yàn)證多重實(shí)時(shí)定量反應(yīng)方法方面疏忽的現(xiàn)象越嚴(yán)重。特別是多重實(shí)時(shí)熒光反應(yīng)多引物-探針組、多模板并存情況下反應(yīng)特異性的交叉驗(yàn)證欠缺普遍。當(dāng)不同模板濃度相差懸殊條件下是否存在PCR競(jìng)爭(zhēng)抑制的問(wèn)題，幾乎被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)者忽視。
此外，驗(yàn)證多重實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)方法的可重復(fù)性、結(jié)果再現(xiàn)能力、PCR效率和LOD線性區(qū)間等問(wèn)題，業(yè)內(nèi)尚未達(dá)成一致。
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